На начальном этапе исследования будет уточнен фенотип полученных ранее линий гороха с введенной аллелью гена LykX, полученной от диких разновидностей гороха. Будут проведены предварительные эксперименты по оценке полезного влияния наличия аллели LykX, придающей высокую специфичность, на семенную продуктивность и белковый состав семян гороха. Белковый состав семян будет оценен также в отношении доли присутствующих в тотальном белке амилоидов, что важно для пищевой ценности сельскохозяйственной продукции. Также будут проведены скрещивания серии современных сортов гороха с дикорастущими разновидностями для моделирования процесса традиционной селекции.

В лаборатории генной и клеточной инженерии СПбГУ разработаны методы геномного редактирования для сельскохозяйственных культур: так, с помощью технологии CRISPR/Cas9 получены растения люцерны с потерей функции ряда генов-регуляторов развития с целью изучения функций этих генов.

Одним из наиболее важных факторов, ограничивающих возможности геномного редактирования и трансформации, является способность модифицированных клеток растения регенерировать, давая начало новому растению с измененным геномом. В связи с этим, поиск морфогенетических регуляторов - генов, стимулирующих регенерацию, является важной задачей для обеспечения успешности геномного редактирования, в особенности для видов растений с низкой способностью к регенерации, к числу которых относится и горох.

Был найден стимулятор регенерации у модельного бобового растения, люцерны - ген MtWOX9-1. Его использование может оптимизировать процесс трансформации и, как следствие, генетического редактирования. Будет проводиться оценка влияния этого и других морфогенетических регуляторов на успешность регенерации и, как следствие, редактирования широкого спектра образцов гороха различного происхождения из коллекции ВИР. Это, возможно, позволит разработать технологию сужения специфичности и тем самым обеспечить возможность полноценного использования способности МРС к симбиотической азотфиксации и достичь поставленных целей по производству полноценного белка.

Основными исследуемыми параметрами будут:

• возможность проведения процедуры геномного редактирования у гороха с использованием морфогенетических регуляторов, в том числе - редактирования гена LykX, который контролирует рецепторный белок, связывающийся с Nod-фактором, и анализ растений после геномного редактирования. Ранее геномное редактирование гороха в мире не проводилось;
• состав бактерий в клубеньках у форм, отличающихся по структуре рецепторов на фоне инокуляции смесью разных штаммов и при выращивании в нестерильной почве;
• количество и качество белка, в том числе белка, способного к агрегации, полученного от различных по специфичности форм из коллекции ВИР;
• общий урожай различных по специфичности МРС;
• подбор форм гороха из коллекции ВИР, различающихся по специфичности взаимодействия.

Актуальность проекта

Актуальность исследований определяется необходимостью ликвидации дефицита белка, который достигает в настоящий момент в Росси не менее одного миллиона тонн в год.  Горох является ценной продовольственной культурой, способной обеспечить получение высококачественного белка с минимальным экологическим риском за счет возможности образования микробно-растительных (МРС) систем, способной фиксировать азот воздуха и тем самым оптимизировать азотное питание не только основной культуры, но и последующих в севообороте.

Именно это свойство позволяет рассматривать перспективность использования гороха для получения белка, поскольку на производство и применение азотных удобрений затрачивается до 50% всей энергии, используемой в сельскохозяйственном производстве. Биологическая азотфиксация позволяет отказаться от таких дорогостоящих  экологически «недружественных» и взрывоопасных агрохимикатов. Таким образом производство  белка гороха становится рентабельным экономически и экологически, несмотря на относительно низкую урожайность данной культуры по сравнению, например, со злаковыми.  Поэтому технология выращивания гороха должна основываться на сортах, с высокой способностью к вступлению в симбиотические отношения и штаммах клубеньковых бактерий, способных проводить фиксацию атмосферного азота максимально эффективно – затрачивая минимальное количество фотосинтатов на фиксацию.

Научная и практическая значимость проекта

Исследование посвящено повышению эффективности МРС путем сужения специфичности взаимодействия при образовании симбиоза растений гороха и клубеньковых бактерий в почве. Основы параллельной селекции бобовых и клубеньковых бактерий в настоящий момент разработаны и включают оценку по симбиотическим свойствам образцов коллекции бобовых ВИРа (коллекция гороха ВИР содержит 8227 образцов из 93 стран мира, включая 15 образцов дикого вида P.fulvum) и селекцию штаммов клубеньковых бактерий, которая выполняется во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Уже имеется сорт гороха (Триумф) с высокими симбиотическими свойствами и коллекция соответствующих штаммов. Разработана технология производства микробных препаратов на их основе, что делает широкое использование биоазота вполне реальной в широких производственных масштабах.

Однако, эта возможность может быть в полной мере реализована при исключении из «соревнования» аборигенных почвенных бактерий, весьма многочисленных в наших почвах для гороха. Будучи хорошо приспособленными для проживания в почве в том числе и без растения-хозяина, эти бактерии успешно конкурируют за места на растении при образовании клубеньков, однако они низко эффективны или даже неэффективны в смысле симбиотической азотфиксации. 

Следовательно, стоит задача создания «умного» гороха» способного выбирать из почвы коммерческие штаммы, а не аборигенные.  Наиболее перспективным решением этой задачи выглядит на основе использования процесса обмена сигналами при узнавании партнеров.  Появление сигнальных молекул (флавонов и флавоноидов) растения вызывает реакцию бактерий, которая заключается в синтезе сигнального соединения из природы хитоолигосахаридов с соответствующим «декором», характерным для различных симбионтов (так называемого Nod-фактора, от англ. nodulation factor). Рецепторы растения с исключительной чувствительностью опознают «свой» сигнал и включают последующую цепь событий. Этот механизм представляется наиболее адекватным для решения поставленной задачи.

Действительно, «научив» горох заселять свои клубеньки только коммерческими, высокоэффективными штаммами, можно добиться значительного повышения урожайности и качества белка, что показано в предварительных исследованиях, проведенных во ВНИИСХМ. Данное свойство можно придать гороху путем классической селекции, что займет значительное время (до 10 лет), однако применение технологии геномного редактирования способно снизить этот срок до 2-3 лет. Таким образом, проведение работы станет основой нового направления в селекции сортов гороха с высокой урожайностью и содержанием доступного белка в семенах, при этом обладающих способностью к специфическому взаимодействию с коммерческими штаммами полезных бактерий.

Ожидаемые результаты

Создание технологии конструирования микробно-растительных (МРС) систем на примере гороха (Pisum sativum L) и клубеньковых бактерий (Rhizobium leguminosarun bv. viciae), свободную от конкуренции посторонней микрофлоры.

Партнеры